После знакомства с таким кратким, но разносторонним обзором можно надеяться, что у читателя появился интерес к более частным вопросам, которые изложены в следующих главах.
Фармацевтическая шнола Виснонсинсного университета, США
Анализ успехов в изучении антибиотиков на протяжении последних 30 лет и стратегии их применения приводит к ряду вопросов.
В настоящий момент известно около 3800 микробных метаболитов, которые проявляют антибиотические свойства.
Сейчас таким путем уже получено около 35 тыс. соединений, включающих примерно 20 тыс. пенициллинов, 10 тыс. цефалоспоринов, тысячи тетрациклинов и рифамицинов, сотни аминогликозидов и линкоми-цинов. Изучение взаимосвязи между структурой и активностью этих производных и аналогов антибиотиков позволило установить у некоторых из них активные центры молекулы, которые обусловливают специфический тип антимикробной активности, а также определенное (иногда нежелательное) фармакологическое и токсическое действие [8].
При применении комбинированных препаратов шансы для возникновения варианта, который был бы одновременно резистентен
к двум антибиотикам так же, как к одному, очень малы [226]. Для появления варианта с двойной резистентностью может оказаться необходимой большая популяция клеток, что также снижает вероятность возникновения резистентности. Кроме того, антибактериальный спектр комбинации может быть расширен как за счет действия более чем двух веществ, так и за счет сочетания антибиотика, с физическими или химическими факторами.
Если курс лечения цефалоспорииом сопровождать одновременным введением эффективного ингибитора р-лактамазы, то отмечается очень заметное усиление антибактериального действия [3]. В качестве ингибиторов р-лактамаз уже исследован ряд веществ. Однако по ряду причин в настоящее время эти вещества пока не начали использовать в терапии, поэтому остается очень широкое поле для дальнейших поисков, которые могут продолжаться до тех пор, пока существуют высокорезистентные возбудители инфекций мочевого тракта.
Исходя из этого, сочетание ампициллина и эритромицина или последовательное применение ампициллина и эритромицина получило известное, хотя и ограниченное применение при лечении рецидивирующих инфекций, вызванных Proteus. Основной недостаток такого лечения состоит в том, что не все выжившие после контакта с пенициллином формы находятся в виде сферопластов. Очевидно, некоторые из них сохраняют морфологически интактную форму и поэтому нечувствительны к эритромицину.
Однако с течением времени это возражение теряет силу. Комбинация ТМП -f- СМЗ используется в Англии 8 лет; такое сочетание препаратов назначают пациентам с энтеробактериальными инфекциями, когда микроорганизмы имеют плазмиды, обусловливающие высокую устойчивость к сульфонамидам. Сомнительно, что для таких пациентов можно рекомендовать курс лечения только одним ТМП, не вызвав заметного увеличения резистентности.
Такая резистентность оказалась нестабильной при пассировании культуры в бульоне без антибиотика.
Очень сходную ситуацию наблюдали для ТМП, когда фенотипи-ческая устойчивость возникала при концентрациях препарата несколько меньших, чем его минимальная ингибирующая. Ингиби-рующее влияние ТМП на рост культуры проявлялось раньше, чем СМЗ (рис. 6.2).
Непрерывное турбидиметрическое измерение оказалось простым приемом изучения действия антибактериальных веществ и особенно определения наименьшей концентрации препарата, способной вызвать отклонение от нормальной кривой роста, т.
Было высказано предположение, что механизм синергизма между пенициллином и стрептомицином при действии их на энтерококки состоит в том, что пенициллин индуцирует образование L-форм у энтерококков, которые более чувствительны к аминогли-козиду, чем исходные клетки [8]. Другой механизм был предложен на основании результатов исследования с меченым стрептомицином. Оказалось, что энтерококки относительно непроницаемы для этого вещества, однако связывание аминогликозида в клетках бактерий сильно возрастало в присутствии пенициллина [21].
Устойчивые к р-лактамазам пенициллииы обладают небольшой антибактериальной активностью против грамотрицательных бактерий, но в силу их большого сродства к р-лактамазам они защищают от разрушения лабильные пенициллины широкого спектра действия путем ингибирования этого фермента.
ными антибиотиками, а также антибактериальная активность in vitro и vivo комбинаций, состоящих из равных частей ампициллина и клоксациллина против трех культур В-лактамазообра-зующих бактерий.
Считается, что низин действует на стадии набухания перед разрывом споровой оболочки [1, 30]. На рисунке 8.2 показаны стадии прорастания, которые подавляются низином и некоторыми другими консервантами. Тип разрыва споровой оболочки, видимо, коррелирует с резистентностью к низину: виды (например, В. subtilis), у которых разрыв споровой оболочки происходит при механическом давлении (тип М), чувствительны к 2 — 10 ИЕ/мл низина, тогда как виды с крупными спорами (например, В.
Биосинтез полипептидных антибиотиков до сих пор полностью не выяснен. Они могут синтезироваться ферментативно, минуя ри-босомальный механизм, поскольку инвариантность генетического кода исключает рибосомальный синтез антибиотиков, содержащих необычные аминокислоты [9]. Однако результаты ингибирования биосинтеза низина такими ингибиторами белкового синтеза, как хлорамфеникол, пуромицин и хлортетрациклин, говорят в пользу рибосомального механизма синтеза низина [61].
Большая чувствительность резистентных к низину стрептококков к нежелательным факторам (желчь, повышенная температура, медицинские антибиотики) по сравнению с родительскими штаммами, а также то обстоятельство, что местом действия низина на вегетативные формы бактерий является их цитоплазматическая мембрана [124], указывают на то, что повышение метаболической активности имеет особое значение, так как это позволяет клеткам преодолевать нарушения, вызванные изменением цитоплазматичс-ской мембраны, которая становится более проницаемой для токсических веществ.
Тем не менее у клеток изменяется ряд свойств, которые не позволяют использовать их в качестве закваски, как другие штаммы, а именно продолжительная лаг-фаза увеличивает их чувствительность к бактериофагам; низкая терморезистентность приводит, как это имеет место с культурой L. acidophilus, резистентной к 200 ИЕ/мл низина, к неспособности микроба расти с добавкой в молоко 20 ИЕ/мл низина
Опытное производство эдамского сыра с использованием НП-и НР-(низинрезистентной) заквасок было начато в Польше [88], а затем в СССР [78, 79].
Применение таких заквасок будет значительно проще благодаря прогрессу в методах приготовления и защиты заквасок.
НП- и НР-закваски станут и уже становятся более дешевыми и таким образом более доступными, чем применение современного дорогостоящего оборудования для получения бесспорового молока или для удаления спор, имеющихся в молоке, предназначенном для сыроварения.
Наконец, остается еще проблема применения обогащенного низином сухого молока (пока наиболее дешевым препаратом) как стимулятором роста молодых животных.
В большей части ранних работ основное внимание было сосредоточено на определении различных проблем, связанных с повреждением и восстановлением, и лишь в последнее время больше внимания стало уделяться непосредственно учету поврежденных микроорганизмов при подсчете клеток.
Научный интерес к проблеме повреждение — восстановление был направлен на: а) определение природы повреждений, вызываемых различными типами стресса; б) наблюдение и изучение восстановления этих повреждений; в) выявление последовательности повреждений, вызываемых различными первичными и вторичными стресс-факторами у разных организмов.
Однако для определения большинства обитающих в пищевых продуктах микробов или индикаторных организмов необходимо использовать селективные среды. В этих средах содержатся вещества, ингибирующие поврежденные клетки, но не обладающие таким действием на обычные и восстановленные после стрессового воздействия клетки. Поэтому до использования таких селективных сред для культивирования или подсчета необходимо определить, сохраняют ли поврежденные клетки способность к восстановлению в элективных и нестрессовых условиях.
thermosphactum.
Цель данной работы состояла в том, чтобы изучить резистентность М. thermosphactum к SO2 и исследовать возможную роль SO2 в поддержании такой резистентности. Известно, что высокая концентрация С02 при недостатке кислорода способствует селективному развитию М. thermosphactum в свинине, которую хранят под газонепроницаемой пленкой [6]. Недавно было установлено, что культура М. thermosphactum способна усваивать СОг и включать его в аспартат [1].
Для инъекций используют растворы и суспензии, которые вводят внутримышечно, подкожно или внутривенно при лечении острых, клинических форм болезни. Применение подобных лекарственных форм позволяет быстро добиться достаточного уровня препаратов в крови и соответственно на участках заражения.
Когда антибиотики впервые были разработаны для лечения животных, то это в определенной степени было воспринято как продолжение исследований, направленных для целей медицины, и вначале лечили лишь отдельных животных.
coli и салмоиелл. Эдварде отметил важность проблемы остатков антибиотиков в молоке, а также обратил внимание на возможные нежелательные последствия для людей и животных от увеличения числа антибиотикорезистентных штаммов и аллергии [4]. Смит [43] напомнил, что, по данным Уилсона [48], количество резистентных стафилококков у животных в Великобритании возросло с 40 % в 1955 г. до 62 % в 1958 г. и 70 % в 1961 г.
По данным ряда авторов [37], во Франции в 1970 г. в целях интрацистернального введения было использовано 1000 кг антибиотиков для обработки 10 млн. коров, а в других странах, где существует менее жесткий контроль продажи препаратов, очевидно, расход их будет еще больше.
В Северной Ирландии один оптовый торговец только среди ветеринарных специалистов распродал 347 тыс. тюбиков для интрацистернального введения в 1975 г.
coli, выделенные от свиней и домашней птицы [2].
Для того чтобы хорошо уяснить себе механизм действия ба-цитрацина, необходимо подробно описать структуру бактериальной оболочки, которая слагается из клеточной стенки и цитоплаз-матической мембраны.
Эти бактерии имеют сравнительно простую клеточную оболочку, состоящую в основном из трех слоев (рис. 20.1):
1) цитоплазматическая мембрана. Это самый внутренний слой.
Известны опыты по сравнению эффективности муравьиной и пропионовой кислот при обработке зерна с 28%-ной влажностью, которые были проведены в Норвегии [14]. Муравьиная кислота (1%) не оказывала защитного действия, и температура зерна в течение четырех недель повышалась до 65 °С. Пропионовая кислота полностью предохраняла зерно при меньшей концентрации (0,3%). Однако муравьиная кислота все еще используется в ограниченных количествах для сохранения зерна в зимних условиях в Скандинавии, причем доза обработки зерна этой кислотой в 1,8 и 2 раза больше, чем при обработке пропионовой кислотой.
При таком методе сравнения возможны три варианта активности смеси: 1) два вещества А и В, смешанные в определенной пропорции, дают активность, равную сумме составляющих активностей компонентов смеси. В таких случаях используется термин
«аддитивность», так как это ассоциируется с добавлением как в-смысле первоначального значения, так и употребления этого слова в современном языке;
2) два вещества А и В, смешанные в определенной пропорции, дают активность выше суммы составляющих активностей компонентов.
У этой проблемы нет простого решения, так как по сути своей она является социальной и балансирует на грани пользы и вреда для общества.
Наиболее важный вопрос, для решения которого требуются дополнительные данные, состоит в следующем: представляет ли
реальную опасность для здоровья людей резервуар резистентных бактерий, который пополняется в результате продолжающегося применения антибиотиков в ветеринарии.
typhimurium. Вполне возможно, что очень небольшое количество штаммов Е. coli R+ было в пищеварительном тракте цыплят перед началом опыта или же эти штаммы попадали в него некоторое время спустя. Там они стали доминантными благодаря селектирующему действию корма, содержащего антибиотик. Впоследствии они передавали свои R-факторы штаммам S. typhimurium. Эти R+-iuTaMMbi S. typhimurium, в свою очередь, становились доминантными по отношению к своим чувствительным двойникам также благодаря селективному действию корма, содержащего антибиотик.
Это не оказало существенного воздействия на кормовой статус животных, так как скоро стали доступными другие ростстимулирующие антибиотики, такие, как бацитрацин, виргинкямицин, нитровин и флавомицин. Предполагалось, что указанное обстоятельство может оказать влияние на экологию огромной популяции резистентных к тетрациклинам штаммов Е. coli, которая к тому времени имелась у свиней и птицы в Англии.
После знакомства с таким кратким, но разносторонним обзором можно надеяться, что у читателя появился интерес к более частным вопросам, которые изложены в следующих главах.
Фармацевтическая шнола Виснонсинсного университета, США
Анализ успехов в изучении антибиотиков на протяжении последних 30 лет и стратегии их применения приводит к ряду вопросов.
В настоящий момент известно около 3800 микробных метаболитов, которые проявляют антибиотические свойства.
Сейчас таким путем уже получено около 35 тыс. соединений, включающих примерно 20 тыс. пенициллинов, 10 тыс. цефалоспоринов, тысячи тетрациклинов и рифамицинов, сотни аминогликозидов и линкоми-цинов. Изучение взаимосвязи между структурой и активностью этих производных и аналогов антибиотиков позволило установить у некоторых из них активные центры молекулы, которые обусловливают специфический тип антимикробной активности, а также определенное (иногда нежелательное) фармакологическое и токсическое действие [8].
При применении комбинированных препаратов шансы для возникновения варианта, который был бы одновременно резистентен
к двум антибиотикам так же, как к одному, очень малы [226]. Для появления варианта с двойной резистентностью может оказаться необходимой большая популяция клеток, что также снижает вероятность возникновения резистентности. Кроме того, антибактериальный спектр комбинации может быть расширен как за счет действия более чем двух веществ, так и за счет сочетания антибиотика, с физическими или химическими факторами.
Если курс лечения цефалоспорииом сопровождать одновременным введением эффективного ингибитора р-лактамазы, то отмечается очень заметное усиление антибактериального действия [3]. В качестве ингибиторов р-лактамаз уже исследован ряд веществ. Однако по ряду причин в настоящее время эти вещества пока не начали использовать в терапии, поэтому остается очень широкое поле для дальнейших поисков, которые могут продолжаться до тех пор, пока существуют высокорезистентные возбудители инфекций мочевого тракта.
Исходя из этого, сочетание ампициллина и эритромицина или последовательное применение ампициллина и эритромицина получило известное, хотя и ограниченное применение при лечении рецидивирующих инфекций, вызванных Proteus. Основной недостаток такого лечения состоит в том, что не все выжившие после контакта с пенициллином формы находятся в виде сферопластов. Очевидно, некоторые из них сохраняют морфологически интактную форму и поэтому нечувствительны к эритромицину.
Однако с течением времени это возражение теряет силу. Комбинация ТМП -f- СМЗ используется в Англии 8 лет; такое сочетание препаратов назначают пациентам с энтеробактериальными инфекциями, когда микроорганизмы имеют плазмиды, обусловливающие высокую устойчивость к сульфонамидам. Сомнительно, что для таких пациентов можно рекомендовать курс лечения только одним ТМП, не вызвав заметного увеличения резистентности.
Такая резистентность оказалась нестабильной при пассировании культуры в бульоне без антибиотика.
Очень сходную ситуацию наблюдали для ТМП, когда фенотипи-ческая устойчивость возникала при концентрациях препарата несколько меньших, чем его минимальная ингибирующая. Ингиби-рующее влияние ТМП на рост культуры проявлялось раньше, чем СМЗ (рис. 6.2).
Непрерывное турбидиметрическое измерение оказалось простым приемом изучения действия антибактериальных веществ и особенно определения наименьшей концентрации препарата, способной вызвать отклонение от нормальной кривой роста, т.
Было высказано предположение, что механизм синергизма между пенициллином и стрептомицином при действии их на энтерококки состоит в том, что пенициллин индуцирует образование L-форм у энтерококков, которые более чувствительны к аминогли-козиду, чем исходные клетки [8]. Другой механизм был предложен на основании результатов исследования с меченым стрептомицином. Оказалось, что энтерококки относительно непроницаемы для этого вещества, однако связывание аминогликозида в клетках бактерий сильно возрастало в присутствии пенициллина [21].
Устойчивые к р-лактамазам пенициллииы обладают небольшой антибактериальной активностью против грамотрицательных бактерий, но в силу их большого сродства к р-лактамазам они защищают от разрушения лабильные пенициллины широкого спектра действия путем ингибирования этого фермента.
ными антибиотиками, а также антибактериальная активность in vitro и vivo комбинаций, состоящих из равных частей ампициллина и клоксациллина против трех культур В-лактамазообра-зующих бактерий.
Считается, что низин действует на стадии набухания перед разрывом споровой оболочки [1, 30]. На рисунке 8.2 показаны стадии прорастания, которые подавляются низином и некоторыми другими консервантами. Тип разрыва споровой оболочки, видимо, коррелирует с резистентностью к низину: виды (например, В. subtilis), у которых разрыв споровой оболочки происходит при механическом давлении (тип М), чувствительны к 2 — 10 ИЕ/мл низина, тогда как виды с крупными спорами (например, В.
Биосинтез полипептидных антибиотиков до сих пор полностью не выяснен. Они могут синтезироваться ферментативно, минуя ри-босомальный механизм, поскольку инвариантность генетического кода исключает рибосомальный синтез антибиотиков, содержащих необычные аминокислоты [9]. Однако результаты ингибирования биосинтеза низина такими ингибиторами белкового синтеза, как хлорамфеникол, пуромицин и хлортетрациклин, говорят в пользу рибосомального механизма синтеза низина [61].
Большая чувствительность резистентных к низину стрептококков к нежелательным факторам (желчь, повышенная температура, медицинские антибиотики) по сравнению с родительскими штаммами, а также то обстоятельство, что местом действия низина на вегетативные формы бактерий является их цитоплазматическая мембрана [124], указывают на то, что повышение метаболической активности имеет особое значение, так как это позволяет клеткам преодолевать нарушения, вызванные изменением цитоплазматичс-ской мембраны, которая становится более проницаемой для токсических веществ.
Тем не менее у клеток изменяется ряд свойств, которые не позволяют использовать их в качестве закваски, как другие штаммы, а именно продолжительная лаг-фаза увеличивает их чувствительность к бактериофагам; низкая терморезистентность приводит, как это имеет место с культурой L. acidophilus, резистентной к 200 ИЕ/мл низина, к неспособности микроба расти с добавкой в молоко 20 ИЕ/мл низина
Опытное производство эдамского сыра с использованием НП-и НР-(низинрезистентной) заквасок было начато в Польше [88], а затем в СССР [78, 79].
Применение таких заквасок будет значительно проще благодаря прогрессу в методах приготовления и защиты заквасок.
НП- и НР-закваски станут и уже становятся более дешевыми и таким образом более доступными, чем применение современного дорогостоящего оборудования для получения бесспорового молока или для удаления спор, имеющихся в молоке, предназначенном для сыроварения.
Наконец, остается еще проблема применения обогащенного низином сухого молока (пока наиболее дешевым препаратом) как стимулятором роста молодых животных.
В большей части ранних работ основное внимание было сосредоточено на определении различных проблем, связанных с повреждением и восстановлением, и лишь в последнее время больше внимания стало уделяться непосредственно учету поврежденных микроорганизмов при подсчете клеток.
Научный интерес к проблеме повреждение — восстановление был направлен на: а) определение природы повреждений, вызываемых различными типами стресса; б) наблюдение и изучение восстановления этих повреждений; в) выявление последовательности повреждений, вызываемых различными первичными и вторичными стресс-факторами у разных организмов.
Однако для определения большинства обитающих в пищевых продуктах микробов или индикаторных организмов необходимо использовать селективные среды. В этих средах содержатся вещества, ингибирующие поврежденные клетки, но не обладающие таким действием на обычные и восстановленные после стрессового воздействия клетки. Поэтому до использования таких селективных сред для культивирования или подсчета необходимо определить, сохраняют ли поврежденные клетки способность к восстановлению в элективных и нестрессовых условиях.
thermosphactum.
Цель данной работы состояла в том, чтобы изучить резистентность М. thermosphactum к SO2 и исследовать возможную роль SO2 в поддержании такой резистентности. Известно, что высокая концентрация С02 при недостатке кислорода способствует селективному развитию М. thermosphactum в свинине, которую хранят под газонепроницаемой пленкой [6]. Недавно было установлено, что культура М. thermosphactum способна усваивать СОг и включать его в аспартат [1].
Для инъекций используют растворы и суспензии, которые вводят внутримышечно, подкожно или внутривенно при лечении острых, клинических форм болезни. Применение подобных лекарственных форм позволяет быстро добиться достаточного уровня препаратов в крови и соответственно на участках заражения.
Когда антибиотики впервые были разработаны для лечения животных, то это в определенной степени было воспринято как продолжение исследований, направленных для целей медицины, и вначале лечили лишь отдельных животных.
coli и салмоиелл. Эдварде отметил важность проблемы остатков антибиотиков в молоке, а также обратил внимание на возможные нежелательные последствия для людей и животных от увеличения числа антибиотикорезистентных штаммов и аллергии [4]. Смит [43] напомнил, что, по данным Уилсона [48], количество резистентных стафилококков у животных в Великобритании возросло с 40 % в 1955 г. до 62 % в 1958 г. и 70 % в 1961 г.
По данным ряда авторов [37], во Франции в 1970 г. в целях интрацистернального введения было использовано 1000 кг антибиотиков для обработки 10 млн. коров, а в других странах, где существует менее жесткий контроль продажи препаратов, очевидно, расход их будет еще больше.
В Северной Ирландии один оптовый торговец только среди ветеринарных специалистов распродал 347 тыс. тюбиков для интрацистернального введения в 1975 г.
coli, выделенные от свиней и домашней птицы [2].
Для того чтобы хорошо уяснить себе механизм действия ба-цитрацина, необходимо подробно описать структуру бактериальной оболочки, которая слагается из клеточной стенки и цитоплаз-матической мембраны.
Эти бактерии имеют сравнительно простую клеточную оболочку, состоящую в основном из трех слоев (рис. 20.1):
1) цитоплазматическая мембрана. Это самый внутренний слой.
Известны опыты по сравнению эффективности муравьиной и пропионовой кислот при обработке зерна с 28%-ной влажностью, которые были проведены в Норвегии [14]. Муравьиная кислота (1%) не оказывала защитного действия, и температура зерна в течение четырех недель повышалась до 65 °С. Пропионовая кислота полностью предохраняла зерно при меньшей концентрации (0,3%). Однако муравьиная кислота все еще используется в ограниченных количествах для сохранения зерна в зимних условиях в Скандинавии, причем доза обработки зерна этой кислотой в 1,8 и 2 раза больше, чем при обработке пропионовой кислотой.
При таком методе сравнения возможны три варианта активности смеси: 1) два вещества А и В, смешанные в определенной пропорции, дают активность, равную сумме составляющих активностей компонентов смеси. В таких случаях используется термин
«аддитивность», так как это ассоциируется с добавлением как в-смысле первоначального значения, так и употребления этого слова в современном языке;
2) два вещества А и В, смешанные в определенной пропорции, дают активность выше суммы составляющих активностей компонентов.
У этой проблемы нет простого решения, так как по сути своей она является социальной и балансирует на грани пользы и вреда для общества.
Наиболее важный вопрос, для решения которого требуются дополнительные данные, состоит в следующем: представляет ли
реальную опасность для здоровья людей резервуар резистентных бактерий, который пополняется в результате продолжающегося применения антибиотиков в ветеринарии.
typhimurium. Вполне возможно, что очень небольшое количество штаммов Е. coli R+ было в пищеварительном тракте цыплят перед началом опыта или же эти штаммы попадали в него некоторое время спустя. Там они стали доминантными благодаря селектирующему действию корма, содержащего антибиотик. Впоследствии они передавали свои R-факторы штаммам S. typhimurium. Эти R+-iuTaMMbi S. typhimurium, в свою очередь, становились доминантными по отношению к своим чувствительным двойникам также благодаря селективному действию корма, содержащего антибиотик.
Это не оказало существенного воздействия на кормовой статус животных, так как скоро стали доступными другие ростстимулирующие антибиотики, такие, как бацитрацин, виргинкямицин, нитровин и флавомицин. Предполагалось, что указанное обстоятельство может оказать влияние на экологию огромной популяции резистентных к тетрациклинам штаммов Е. coli, которая к тому времени имелась у свиней и птицы в Англии.