Дальнейшее подразделение их, очевидно, произойдет после рентгеноструктурного анализа большей части препаратов и определения их точной структуры.
Известно, что в процессе культивирования большинство продуцентов антибиотиков синтезирует группу химически близких соединений (например, микроорганизм — продуцент гентамицина синтезирует 17 антибиотиков), среди которых химической характеристике бывают подвергнуты, как правило, лишь те из них, которые вырабатываются в больших количествах [6].
Этот сульфонамид был выбран из тех соображений, что время его 50%-ного удаления из организма после перорального введения человеку совпадает с временем 50%-ного удаления ТМП. Совпадение времени 50%-ного удаления препаратов упрощает дозировку,
хотя это не имеет существенного значения. В ветеринарии трудно подобрать пары одинаковых по циркуляции- препаратов, так как у разных животных их фармакокинетика сильно варьирует.
Частота возникновения резистентности к комбинации
Поскольку ошибки при определении чувствительности к комбинации ТМП + СМЗ почти всегда связаны с присутствием в среде тимидина, из-за чего чувствительные штаммы определяются как резистентные, то имеющиеся данные о штаммах резистентных к комбинации препаратов, видимо, требуют дополнительной проверки. Кроме того, опубликованные данные не указывают на значительное распространение инфекций, вызванных резистентными штаммами, возможно, за исключением внутри-больничных инфекций [7, 38, 47, 61, 66].
Микробиологичесний факультет Ноттингемсного университета, городсной госпиталь, Ноттингем
Синергидное взаимодействие между ТМП и сульфонамндами теперь хорошо известно, но остается не выясненным ряд важных вопросов относительно природы и значения этого синергизма. Для получения дополнительных сведений о взаимодействии указанных соединений мы рассмотрели кинетику роста Е. coli (штамм ECSA1, клинический изолят) в присутствии ТМП и СМЗ в двух турбиди-метрических модельных системах.
Самые низкие концентрации комбинации обоих компонентов, достаточные
или МИК/8ТМП+ МИК/ /32 СМЗ. Интересно отметить, что ингибирование роста бактерий комбинациями ТМП с СМЗ всегда характеризуется: задержкой роста за счет действия ТМП, а не сульфонамида, поскольку в присутствии (последнего» рост продолжается б соответствии с обычной кривой в течение нескольких часов до проявления антибактериального действия.
Подобное действие могут оказывать также некоторые другие факторы внешней среды (рН, температура и т. д.) и, возможно, отдельные свойства продуктов, играющие в этом плане важную роль. Например, нагревание может одновременно действовать как антагонистический (инактивация низина), так и синергидный фактор (разрушение спор), поэтому окончательный результат зависит от тонкого равновесия между двумя этими активностями.
Обширные исследования токсикологии низина проведены в Японии [43] и в СССР [17, 59, 132, 137]. Частично этот вопрос рассмотрен и в исследованиях по применению низина в пищевой промышленности [29, 32, 115]. Коммерческие препараты различного производства низина были исследованы по отдельности и в сравнении с другими пищевыми консервантами. Токсикологические тесты прослежены на многих поколениях крыс и мышей, которым вводили нормальные и повышенные дозы низина.
Изучение эффективности ряда веществ (глицина, лейцина, пропионата кальция и низина) как ингибиторов маслянокислого брожения в переработанном сыре показало несомненное преимущество низина [120].
При этом установили синергидный эффект низина и соли при действии на споровые формы в переработанном сыре [121]. Интенсивное изучение и полученные данные о влиянии низина на сохраняемость такого сыра, изготовленного с использованием разного количества хлористого натрия, плавких солей (см.
, /
Поврежденные бактериальные клетки становятся гиперчувстви-тельными к вторичным воздействиям, которым они могут подвергаться в разнообразных производственных процессах и которые не всегда можно учесть. Среди таких вторичных воздействий могут быть не только очевидные, как, например, селективные, но и другие, оказывающие достаточное ингибирующёе действие даже на клетки, не подвергнутые первичному воздействию.
На рисунке 10.1 показана слабая типируемость культур с помощью указанного набора фагов.
Впоследствии все эти изоляты были типированы с помощью
набора фагов бычьего типа [5], что позволило дополнительно протипировать еще три штамма, выделенных из сыра. Три последних штамма и восемь других, типированных с помощью обоих наборов фагов, поддавались типизации по RTD вместо 1000 RTD, как это бывает при использовании набора фагов человеческого типа.
Блоки сыра хранили при температуре 22 °С.
В результате опыта было установлено, что число неказеиноли-тических бактерий, выделенных как от человека, так и от животных, при культивировании быстро уменьшалось (рис. 10.8), тогда как число казеинолитических микроорганизмов сохранялось в течение семи дней. Если блоки сыра хранили при температуре —8°, 4° и 22 °С, то между штаммами наблюдалось статистически достоверное различие в выживаемости при каждой температуре.
Сгусток перемешивали при каждом внесении культуры и еще 5 мин после последнего добавления. Затем по обычной методике сыры оставляли для созревания при 15 °С. Каждый тип сыра готовили с дубликатом. Вследствие малого формата: сыров прокалывание не делали. Для подсчета микроорганизмов из середины головки брали 2 кусочка по 1 г и гомогенизировали, в 0,25 н. растворе Рингера. Результаты подсчета микроорганизмов (рис.
coli, могут наблюдаться в течение 12 ч после появления приплода, если же лечение не проводить, то в течение 48 ч возможна гибель животных.
Исследование эффективности амоксициллина и ампициллина против естественной и искусственной диареи, вызванной колифор-мами, показало, что раннее пероральное введение препаратов предотвращает гибель животных. Зараженным поросятам необходимо давать антибиотики один или два раза в день в течение трех дней.
Однако в обозримом будущем применение антибиотикотерапии вместе с другими профилактическими мероприятиями должно предотвратить бесконечные поносы и пневмонии, наблюдаемые на многих фермах.
В данном случае свиноводческое хозяйство было выбрано для того, чтобы продемонстрировать взаимосвязь между бактериальными инфекциями и другими заболеваниями, которые встречаются на современной ферме. На фермах по разведению крупного рогатого скота поносы и пневмония также обусловлены спецификой хозяйства, но бактерии также составляют определенную часть в общем числе случаев инфекции.
Образцы располагают в четырехкратной повторности по латинскому квадрату 10X8, чтобы подсчитать любые возможные вариации на пластинке. Применяются цилиндрики диаметром от 8 до 14 мм.
Определение каждого антибиотика проводится по калибровочной кривой. Для того чтобы сравнить результаты разных опытов, в анализы всегда включали контрольный стандартный образец. Экспериментальные результаты считали достоверными в том случае, если они не выходили за пределы стандартных отклонений.
Другими словами, используя данный метод, в указанных органах можно обнаружить антибиотики; если они были введены животным. С экономической точки зрения диафрагма, моча и сыворотка крови не представляют ша-чительной ценности и являются наиболее подходящими объектами для отбора образцов. Однако стоит отметить, что после оглушения
при убое некоторые животные могут выделять мочу непроизвольно, так что образцы ее оказываются не всегда доступными.
Опыты, показавшие повышение резистентности к заражению у лабораторных животных после внутримышечного введения им эндотоксина, были продолжены на дойных коровах. Внутримышечное введение коровам эндотоксина приводило к повышению антимикробной активности сыворотки крови против Е. coli [16]. Эта антимикробная активность оказалась комплементзависимой и исчезла после прогревания сыворотки крови в продолжение 30 мин при 56° С (рис.
Выявление указанного антибактериального действия осуществляется отчасти такими непрямыми методами, как увеличение чувствительности к некоторым химиотерапевтическим веществам, или по замене одного вида бактерий другим внутри одного рода, но с отличающимися биохимическими свойствами. Подобная замена хорошо видна на примере стрептококков группы D у свиней и домашней птицы. Действию ростстимулирующих веществ было подвергнуто множество типов бактерий.
При испытании чувствительности клеток, обработанных цинк-бацитрацином, к другим антибиотикам было установлено, что минимальная ингибирующая рост концентрация этих лекарств уменьшается по сравнению с ее значением до обработки бацитрацином. Это обстоятельство не явилось полной неожиданностью, так как цинк-бацитрацин, нарушая целостность мембран и ингибируя синтез пептидогликанов, тем самым увеличивает проницаемость клеточной стенки, и поэтому поврежденные клетки становятся более проницаемыми для других антибиотиков.
Но по ряду важных свойств он отличается от ампициллина. Во-первых, при пероральном введении он абсорбируется лучше, чем ампициллин [1]. Кроме того, он значительно раньше проявляет бактерицидное действие на некоторые штаммы бактерий in vivo и in vitro при испытании на мелких животных [3, 5].
В ряде инфекций, включая бактериальную инвазию органов и тканей, особенно важно, чтобы антибиотик накапливался в сыворотке в терапевтических уровнях и затем мог легко диффундировать из нее в ткань на участке инфекции.
По мере возрастания интенсивности применения антибиотиков увеличились и число резистентных штаммов, а также степень резистентности бактерий, что привело к возникновению ряда серьезных клинических проблем. Поэтому при выборе наиболее благоприятного препарата для лечения как с точки зрения его фармакологических свойств, так и стоимости необходимо учитывать резистентные свойства инфекционных микроорганизмов.
Прикрепление бактерий к стенке кишечника может быть обусловлено их специфической поверхностной структурой, в которую входят О-антигены. Все изоляты Е. coli от животных были подвергнуты О-серотипированию,. и определено их разнообразие внутри каждого вида животных. Суммарные результаты приведены в таблице 26.10. Помимо определения разнообразия серотипов у индивидуальных животных, были получены ^доказательства, что набор О-серотипов в микрофлоре кишечника мясных животных очень обширен и мало отличается от такового у человека.
, ситуация среди поголовья свиней в Англии была такова, что у 36 % беконных свиней и 18 % молодняка на продажу практически все штаммы Е. coli оказались резистентными к тетрациклину [28]. Указанные факты представили большой интерес для экологии, но в то время они не привлекли должного внимания со стороны ветеринарии и медицины. Постепенное осмысливание открытия, сделанного японскими учеными в 1959 г.
Такая возможность стала более очевидной с 1967 г., когда было установлено, что резистентность к тетрациклину у большинства непатогенных Е. coli из пищеварительного тракта свиней и птицы, содержащихся на рационе с тетрациклином, является резистентностью передаваемого типа. Так, резистентность к тетрациклину была передана от 22 из 30 штаммов, выделенных
от свинейлиз различных стад, содержащихся на рационе с тетрациклином, и от 27 из 30 штаммов, выделенных от цыплят на таком же рационе [25].
О большом распространении резистентности среди штаммов S. typhimurium, выделенных от больных телят в Англии, сообщили Стивене и др. [34]; в частности, все изученные ими штаммы фаготипа 29 оказались резистентными к тетрациклинам, стрептомицину и сульфонамидам. В Англии никогда не разрешалось использовать антибиотики в качестве кормовой добавки для стимуляции роста, так что это не могло быть причиной резистентности к антибиотикам, о которой сообщили указанные авторы.
coli у свиней незначительно уменьшилось, хотя число свиней, выделяющих эти микроорганизмы (100 % в 1975 г.), осталось прежним. Недостаточная эффективность принятых мер, как это видно на примере отдельных хозяйств (тарл. 27.6), могла быть результатом длительного контакта популяции Е. coli с тетрациклинами, что привело к возникновению резистентных штаммов, конкурирующих с чувствительными штаммами. Уменьшение числа тетрациклин-резистентных штаммов с передаваемой резистентностью, начиная с 1970 г.
Дальнейшее подразделение их, очевидно, произойдет после рентгеноструктурного анализа большей части препаратов и определения их точной структуры.
Известно, что в процессе культивирования большинство продуцентов антибиотиков синтезирует группу химически близких соединений (например, микроорганизм — продуцент гентамицина синтезирует 17 антибиотиков), среди которых химической характеристике бывают подвергнуты, как правило, лишь те из них, которые вырабатываются в больших количествах [6].
Этот сульфонамид был выбран из тех соображений, что время его 50%-ного удаления из организма после перорального введения человеку совпадает с временем 50%-ного удаления ТМП. Совпадение времени 50%-ного удаления препаратов упрощает дозировку,
хотя это не имеет существенного значения. В ветеринарии трудно подобрать пары одинаковых по циркуляции- препаратов, так как у разных животных их фармакокинетика сильно варьирует.
Частота возникновения резистентности к комбинации
Поскольку ошибки при определении чувствительности к комбинации ТМП + СМЗ почти всегда связаны с присутствием в среде тимидина, из-за чего чувствительные штаммы определяются как резистентные, то имеющиеся данные о штаммах резистентных к комбинации препаратов, видимо, требуют дополнительной проверки. Кроме того, опубликованные данные не указывают на значительное распространение инфекций, вызванных резистентными штаммами, возможно, за исключением внутри-больничных инфекций [7, 38, 47, 61, 66].
Микробиологичесний факультет Ноттингемсного университета, городсной госпиталь, Ноттингем
Синергидное взаимодействие между ТМП и сульфонамндами теперь хорошо известно, но остается не выясненным ряд важных вопросов относительно природы и значения этого синергизма. Для получения дополнительных сведений о взаимодействии указанных соединений мы рассмотрели кинетику роста Е. coli (штамм ECSA1, клинический изолят) в присутствии ТМП и СМЗ в двух турбиди-метрических модельных системах.
Самые низкие концентрации комбинации обоих компонентов, достаточные
или МИК/8ТМП+ МИК/ /32 СМЗ. Интересно отметить, что ингибирование роста бактерий комбинациями ТМП с СМЗ всегда характеризуется: задержкой роста за счет действия ТМП, а не сульфонамида, поскольку в присутствии (последнего» рост продолжается б соответствии с обычной кривой в течение нескольких часов до проявления антибактериального действия.
Подобное действие могут оказывать также некоторые другие факторы внешней среды (рН, температура и т. д.) и, возможно, отдельные свойства продуктов, играющие в этом плане важную роль. Например, нагревание может одновременно действовать как антагонистический (инактивация низина), так и синергидный фактор (разрушение спор), поэтому окончательный результат зависит от тонкого равновесия между двумя этими активностями.
Обширные исследования токсикологии низина проведены в Японии [43] и в СССР [17, 59, 132, 137]. Частично этот вопрос рассмотрен и в исследованиях по применению низина в пищевой промышленности [29, 32, 115]. Коммерческие препараты различного производства низина были исследованы по отдельности и в сравнении с другими пищевыми консервантами. Токсикологические тесты прослежены на многих поколениях крыс и мышей, которым вводили нормальные и повышенные дозы низина.
Изучение эффективности ряда веществ (глицина, лейцина, пропионата кальция и низина) как ингибиторов маслянокислого брожения в переработанном сыре показало несомненное преимущество низина [120].
При этом установили синергидный эффект низина и соли при действии на споровые формы в переработанном сыре [121]. Интенсивное изучение и полученные данные о влиянии низина на сохраняемость такого сыра, изготовленного с использованием разного количества хлористого натрия, плавких солей (см.
, /
Поврежденные бактериальные клетки становятся гиперчувстви-тельными к вторичным воздействиям, которым они могут подвергаться в разнообразных производственных процессах и которые не всегда можно учесть. Среди таких вторичных воздействий могут быть не только очевидные, как, например, селективные, но и другие, оказывающие достаточное ингибирующёе действие даже на клетки, не подвергнутые первичному воздействию.
На рисунке 10.1 показана слабая типируемость культур с помощью указанного набора фагов.
Впоследствии все эти изоляты были типированы с помощью
набора фагов бычьего типа [5], что позволило дополнительно протипировать еще три штамма, выделенных из сыра. Три последних штамма и восемь других, типированных с помощью обоих наборов фагов, поддавались типизации по RTD вместо 1000 RTD, как это бывает при использовании набора фагов человеческого типа.
Блоки сыра хранили при температуре 22 °С.
В результате опыта было установлено, что число неказеиноли-тических бактерий, выделенных как от человека, так и от животных, при культивировании быстро уменьшалось (рис. 10.8), тогда как число казеинолитических микроорганизмов сохранялось в течение семи дней. Если блоки сыра хранили при температуре —8°, 4° и 22 °С, то между штаммами наблюдалось статистически достоверное различие в выживаемости при каждой температуре.
Сгусток перемешивали при каждом внесении культуры и еще 5 мин после последнего добавления. Затем по обычной методике сыры оставляли для созревания при 15 °С. Каждый тип сыра готовили с дубликатом. Вследствие малого формата: сыров прокалывание не делали. Для подсчета микроорганизмов из середины головки брали 2 кусочка по 1 г и гомогенизировали, в 0,25 н. растворе Рингера. Результаты подсчета микроорганизмов (рис.
coli, могут наблюдаться в течение 12 ч после появления приплода, если же лечение не проводить, то в течение 48 ч возможна гибель животных.
Исследование эффективности амоксициллина и ампициллина против естественной и искусственной диареи, вызванной колифор-мами, показало, что раннее пероральное введение препаратов предотвращает гибель животных. Зараженным поросятам необходимо давать антибиотики один или два раза в день в течение трех дней.
Однако в обозримом будущем применение антибиотикотерапии вместе с другими профилактическими мероприятиями должно предотвратить бесконечные поносы и пневмонии, наблюдаемые на многих фермах.
В данном случае свиноводческое хозяйство было выбрано для того, чтобы продемонстрировать взаимосвязь между бактериальными инфекциями и другими заболеваниями, которые встречаются на современной ферме. На фермах по разведению крупного рогатого скота поносы и пневмония также обусловлены спецификой хозяйства, но бактерии также составляют определенную часть в общем числе случаев инфекции.
Образцы располагают в четырехкратной повторности по латинскому квадрату 10X8, чтобы подсчитать любые возможные вариации на пластинке. Применяются цилиндрики диаметром от 8 до 14 мм.
Определение каждого антибиотика проводится по калибровочной кривой. Для того чтобы сравнить результаты разных опытов, в анализы всегда включали контрольный стандартный образец. Экспериментальные результаты считали достоверными в том случае, если они не выходили за пределы стандартных отклонений.
Другими словами, используя данный метод, в указанных органах можно обнаружить антибиотики; если они были введены животным. С экономической точки зрения диафрагма, моча и сыворотка крови не представляют ша-чительной ценности и являются наиболее подходящими объектами для отбора образцов. Однако стоит отметить, что после оглушения
при убое некоторые животные могут выделять мочу непроизвольно, так что образцы ее оказываются не всегда доступными.
Опыты, показавшие повышение резистентности к заражению у лабораторных животных после внутримышечного введения им эндотоксина, были продолжены на дойных коровах. Внутримышечное введение коровам эндотоксина приводило к повышению антимикробной активности сыворотки крови против Е. coli [16]. Эта антимикробная активность оказалась комплементзависимой и исчезла после прогревания сыворотки крови в продолжение 30 мин при 56° С (рис.
Выявление указанного антибактериального действия осуществляется отчасти такими непрямыми методами, как увеличение чувствительности к некоторым химиотерапевтическим веществам, или по замене одного вида бактерий другим внутри одного рода, но с отличающимися биохимическими свойствами. Подобная замена хорошо видна на примере стрептококков группы D у свиней и домашней птицы. Действию ростстимулирующих веществ было подвергнуто множество типов бактерий.
При испытании чувствительности клеток, обработанных цинк-бацитрацином, к другим антибиотикам было установлено, что минимальная ингибирующая рост концентрация этих лекарств уменьшается по сравнению с ее значением до обработки бацитрацином. Это обстоятельство не явилось полной неожиданностью, так как цинк-бацитрацин, нарушая целостность мембран и ингибируя синтез пептидогликанов, тем самым увеличивает проницаемость клеточной стенки, и поэтому поврежденные клетки становятся более проницаемыми для других антибиотиков.
Но по ряду важных свойств он отличается от ампициллина. Во-первых, при пероральном введении он абсорбируется лучше, чем ампициллин [1]. Кроме того, он значительно раньше проявляет бактерицидное действие на некоторые штаммы бактерий in vivo и in vitro при испытании на мелких животных [3, 5].
В ряде инфекций, включая бактериальную инвазию органов и тканей, особенно важно, чтобы антибиотик накапливался в сыворотке в терапевтических уровнях и затем мог легко диффундировать из нее в ткань на участке инфекции.
По мере возрастания интенсивности применения антибиотиков увеличились и число резистентных штаммов, а также степень резистентности бактерий, что привело к возникновению ряда серьезных клинических проблем. Поэтому при выборе наиболее благоприятного препарата для лечения как с точки зрения его фармакологических свойств, так и стоимости необходимо учитывать резистентные свойства инфекционных микроорганизмов.
Прикрепление бактерий к стенке кишечника может быть обусловлено их специфической поверхностной структурой, в которую входят О-антигены. Все изоляты Е. coli от животных были подвергнуты О-серотипированию,. и определено их разнообразие внутри каждого вида животных. Суммарные результаты приведены в таблице 26.10. Помимо определения разнообразия серотипов у индивидуальных животных, были получены ^доказательства, что набор О-серотипов в микрофлоре кишечника мясных животных очень обширен и мало отличается от такового у человека.
, ситуация среди поголовья свиней в Англии была такова, что у 36 % беконных свиней и 18 % молодняка на продажу практически все штаммы Е. coli оказались резистентными к тетрациклину [28]. Указанные факты представили большой интерес для экологии, но в то время они не привлекли должного внимания со стороны ветеринарии и медицины. Постепенное осмысливание открытия, сделанного японскими учеными в 1959 г.
Такая возможность стала более очевидной с 1967 г., когда было установлено, что резистентность к тетрациклину у большинства непатогенных Е. coli из пищеварительного тракта свиней и птицы, содержащихся на рационе с тетрациклином, является резистентностью передаваемого типа. Так, резистентность к тетрациклину была передана от 22 из 30 штаммов, выделенных
от свинейлиз различных стад, содержащихся на рационе с тетрациклином, и от 27 из 30 штаммов, выделенных от цыплят на таком же рационе [25].
О большом распространении резистентности среди штаммов S. typhimurium, выделенных от больных телят в Англии, сообщили Стивене и др. [34]; в частности, все изученные ими штаммы фаготипа 29 оказались резистентными к тетрациклинам, стрептомицину и сульфонамидам. В Англии никогда не разрешалось использовать антибиотики в качестве кормовой добавки для стимуляции роста, так что это не могло быть причиной резистентности к антибиотикам, о которой сообщили указанные авторы.
coli у свиней незначительно уменьшилось, хотя число свиней, выделяющих эти микроорганизмы (100 % в 1975 г.), осталось прежним. Недостаточная эффективность принятых мер, как это видно на примере отдельных хозяйств (тарл. 27.6), могла быть результатом длительного контакта популяции Е. coli с тетрациклинами, что привело к возникновению резистентных штаммов, конкурирующих с чувствительными штаммами. Уменьшение числа тетрациклин-резистентных штаммов с передаваемой резистентностью, начиная с 1970 г.